Генното инженерство - studopediya

План: генно инженерство.

Hybridoma технология за извършване на моноклонални антитела

Терминът "биотехнология" е широко разпространен през 70-те години на този век. Биотехнологии се основава, от една страна, от древната традиция на ферментация и микробиологични кал индустрии, от друга - на най-новите открития на биолозите физическите науки. Биотехнологии - науката за използване на живите организми и биологични процеси в производството. Това ком-Plex мултидисциплинарен научно и технологично про-Gressa включително разнообразен микробен синтез, генетичен и клетъчно инженерство, инженерна enzimolo-Gia. Биотехнология появи на кръстопътя на микробиология, биохимия и биофизика, генетика и молекулярна генетика, цитология и имунология. нивото на развитие, че до голяма степен определя научни и технически потенциал на страната. Цената на глобалното производство на biotehnolo кал до края на ХХ век. експерти прогнозират, ще достигне $ 20 милиарда. Напредъкът на биотехнологиите в животно-дането през следващите 10-15 години ще се определя от развитието на генетична, клетъчно и embryogenetic инженерство.

Генното инженерство - секцията на биотехнологиите, свързани с целенасочено управление ин витро изграждане на нови комбинации от генетично-един материал може да се възпроизведе в клетка и синтезира ДДС определен продукт.

Генното инженерство има следните цели:

1) получаване на гени от техния синтез или изолиране от адхезив ток;

2) Получаване на рекомбинантни ДНК молекули;

3) Клониране на гени или генетични структури;

4) въвеждане в клетка на гени или генетични структури и син-MES чужд протеин.

Получаване на гени. Има два метода за изкуствен син-тезата на гени извън тялото - химически и ензимни. Хи-тират от 1969 American Scientist G. Koran и сътр. синтезира аланин тРНК ген на дрожди. Този ген се състои от 77 двойки нуклеотиди, последователността на които е

Той вече е бил дешифриран. Учените първо синтезирани ДНК чуплив-менти с дължина от 5 до 12 нуклеотиди, и след това да ги поставят заедно в определен ред с помощта на времето за откриване на лигазен ензим. Въпреки тРНК ген аланин когато е въведен в клетка на Ешерихия коли или клетъчна среда без-niroval не функционира. Оказа се, че той не е имал регулаторни елементи - промотора, където локализиран точка за започване на синтеза, и термо-нителна кодони, които дават сигнал за завършване на синтеза на иРНК През 1976, G. и сътр измама. Ние извършва синтеза на супресорната тирозин тРНК ген на 126 нд дължина NUS-leotidov. Те също така са синтезирани ген, съседен на регулиране-Акумулатори части: промотор (52 базови двойки), и терминът-тор (21 нуклеотидна двойка) и прикрепен към края на полимера и tetranucleotides AATT TTAA. В този случай, изкуствено синтезиран ген вмъква в генома на мутантния Т4 фаг, когато се въведе в живо колиформени беше rabotospo, които са в състояние. През 1979 г. в страната под ръководството на Ю Ov chinnikova и М. N. Kolosova химически чрез ензими синтезира гени на човешки хормони и Ms-votnyh - енкефалин и брадикинина.

Химическа-ензимна синтеза доста широко разтваря в прилагането на генното инженерство за получаване на малки гени. За полу-cheniya гени на животни, растения и хора, размерът на която е 1000-3000 нуклеотида в дължина, този метод е твърде сложно и досега не е възможно. Учените са установили по-лесен начин в радиационните такива гени.

През 1970 G. G. Temin и сътр. намерено ензим обратна транскриптаза (обратна транскриптаза). През 1972 г. е открито, че nekoto ръж онкогенни вируси, използвайки обратна транскриптаза може да синтезира ДНК използване на иРНК като матрица. По-нататъшно проучване показа, че матрицата за копията на изображения бани на ДНК може да служи не само на онкогенни вируси РНК, но и други иРНК. Това по принцип е възможно да ензимната синтеза на всички индивидуални гени (DNA) при използване на РНК копия от тях. При ензимната синтеза на генна транскрипция означава-допълване, солна верига ДНК (ген) РНК молекули ин витро. синтез система е разтвор, който съдържа всички четири нуклеотиди, които изграждат ДНК, магнезиеви йони, ензимът обратна транскриптаза (получен от неговите онкогенни вируси) и матрица (информация) РНК, кодирана от гена, копие от която се стреми да се отстрани. В иРНК-ценен обратна транскриптаза синтезира комплементарна ДНК верига, и след това да го чрез същия ензим синтезира втора ДНК нишка. Резултатът е генна структура е същата като тази, която се синтезира иРНК.

По този начин, в лабораториите на много страни, цяла поредица от гени. В нашата страна, ръководството на йод В. А. Engelgardta е изготвена "обратната транскриптаза" - програма за синтез на ген с помощта на този ензим. Изпълнението на проекта присъстваха водещи национални и международни институции. В резултат, 1974-1978 това се синтезира гр. Глобин гени гълъб, заешки и човешки, както и гени на черен дроб на плъх митохондрии, частта от гена, кодиращ миши имунни протеини и други.

Гените синтезирани чрез обратна препис-PS, не са регулирани области функционално неактивна HN. Следователно, транскрипция на ДНК копия се препоръчва да се про-иРНК, които имат всички необходими копия на регулаторни части от гена.

Други методи, описани ген могат да бъдат получени от vyde-среда с помощта на трансдукция фаги. По този начин, през 1969 г., първо беше изолиран лактоза гена на Е.коли. Въпреки това, този метод на получаване на гени винаги не е подходящ, тъй като тя дава възможност за стриктно пространство на фаг локализация. Следователно, използването на други методи за изолиране на ДНК фрагменти с гени, необходими за прехвърляне.

Рестрикционна ендонуклеаза (рестрикционен ензим). Thieme-на сво- portant за развитието на генното инженерство е откриването на ензимите в клетките на бактерии, способни на рязане ДНК молекула в експлоатация първите специфични места. Тези ензими се наричат ​​рестрикционни фрагмент-ал ендонуклеази или рестрикционни ензими, и процеса на "режещата ЛИЗАЦИЯ" на молекулата на ДНК, наречен рестрикционно смилане. С рестрикционни ензими свързани напредък в молекулярната биология. Те са се превърнали в един от ключовите елементи на генното инженерство. ДНК сегмент разпознаваем специално рестрикционен ензим, съдържа графично спе-последователност от около осем базови двойки палиндром е Xia. Палиндром е последователност на ДНК, която се чете еднакво и в двете посоки от Z'-края на всяка верига. Например, Е. coli, наречен рестрикционен ензим EcoRI разпознава секвенция

и се свързва с нея, едно едноверижна прорез от двете страни, т.е.. е. тя намалява в симетрични части, посочени със стрелки. Получената двойно-верижна ДНК молекула, ако пръстенът има придобива линейна структура поради разкъсване. В краищата на молекулата образува лепливи краища, предвидени едноверижни участъци на четири nukleoti-ING: в единия край е ООТТ последователността, * в Дрю-г - TTAA. В присъствието на лепкавите краища на линеен ДНК молекула е в състояние на повторно форма в пръстена без по-нататъшно лечение. рестрикционни ензими са открити, ноу-Ing голямо разнообразие от нуклеотидни последователности. На-пример, рестрикционния ензим разпознава секвенция EcoRII TSTSTGG.

Понастоящем съществуват над 200 известни рестрикционни ензими, характеризираща-Terni на различни видове микроорганизми. Това отваря нови възможности за експериментатори. Голям молекули височина Shih организми включват голям брой режещи сайтове за рестрикционни ензими. При лечението на ДНК с рестрикционни ензими Obra форма на множество ДНК фрагменти, в които отделните представяния HN гени. След това, гените могат да бъдат свързани в определена структура. Останалите пропуските в такава структура, привеждане ДНК нишки лигаза. Има и друг метод за получаване на ДНК фрагменти с лепливи краища. Тя се състои в това, че изолирани или синтезирани изкуствено части на ДНК-OPS ендонуклеаза съкращаване ДНК региони в двата края, и след това с помощта на ензимно-polinukleotidtran sferazy паркиран в тази последователност завършва и лаурил-аденил тимидилова нуклеотиди. Дължина лепкава поли-А и поли-Т е 50-100 нуклеотида. Когато добавя ген във вектор използва както за метода и изследвани често заедно.

Rekbmbinantnye ДНК. Рекомбинантен ДНК е изку-venno получената ДНК молекула. Той има формата на пръстен, включва ген (гени), представляваща обект-генетичен манипулирането lyatsy, и така наречената вектор осигурява възпроизвеждане синтез и рекомбинантна ДНК в клетка гостоприемник на даден продукт, кодиран от гена изменен. Векторите включват тези компоненти на рекомбинантна ДНК, които са способни на приелите-MENT чужди гени и гарантират тяхната репликация в гостоприемни клетки. Векторите трябва да имат следните характеристики: 1) имат свойства репликон; 2) да субстрата сайтове за рестрикционни ензими, или невъзможно Обновяване ДНК; 3) включва един или повече маркерни гени до фенотип може да определи дали предаването му. Проучванията показват, че ефективни вектори са плазмиди. От тези вектори се използват като Col El, PSC 101 и други. От вируси като вектори, използвайки фаг А. SV 40 и техни производни. Vekto-RY придаде способност рекомбинантна молекула ditsya пускане независимо от бактериална клетъчна хромозома.

Съединение на вектора с ДНК фрагмента може да се извърши по следните начини: чрез използване на кохезивни краища, получени от ДНК чрез действието на рестрикционни ендонуклеази; Syn теза на допълнителни полинуклеотидни фрагменти от всяка ДНК нишка (поли-А и поли-Т); Свързване тъпи краища с помощта на Т4 лигаза.

Фигура 25 показва гена ензимна синтеза и вкарването му в плазмиден вектор. Ляв на иРНК, използвайки обратна транскриптаза синтезира ДНК верига (сДНК), тРНК след това се отстранява чрез алкален и чрез ДНК полимераза се завърши втора нишка сДНК, екзонуклеазна UCO-rachivayut двете вериги на ДНК и терминална трансфераза зашива към краищата поли Т последователност. Същата цифра

Фиг. 25. Ензимен синтез на N генен вграждането му във вектор плазмид

(С SM Gershevdonu)

отдясно показва, че кръгова ДНК плазмиден вектор време Резай рестрикционен ензим и се превръща в линейна форма, и след това се скъсява екзонуклеазна верига и терминална трансфераза в Шива него поли А последователност. В последния етап е свързан двата типа ДНК молекули, за да се получи хибридна мол кула - вектор плазмид с интегрирана в него синтезира Nym геном. Прекъсвания в ДНК нишки съберат лигаза.

В този случай, това е известно, който ген включен в вектор-Ing плазмида. Но в произведенията за трансгенни по-вероятно да се наложи да се справят с много фрагменти на ДНК, а сред тях включва само един ген, който трябва да бъде прехвърлен. За ДНК фрагменти с определен ген използва така наречения метод пушка, която се състои в това механично или ДНК ензими се разделя на много малки фрагменти, след което се сляпо хибридизират с вектор ДНК молекули. Преди този вектор ДНК се обработва restrik-tazoy за придаване на линейна форма и образуването на лепливи краища. След въвеждане на рекомбинантни молекули в E.coli, използвайки селективна среда секретират тези бактерии в което фрагментът ДНК се гена. Освен генен продукт се открива чрез неговото действие под формата на определено вещество (ензим, хормон, и така нататък. D.). Възпроизвеждането в бактерии

идентичен наречен рекомбинантна ДНК клониране. Всеки клон съдържа рекомбинантна ДНК бактерии. Развитите методи за производство на нуклеотидни замествания в ДНК на клонирания ген и по този начин да променят свойствата на протеина, кодиран от този ген.

Въвеждане в клетка на рекомбинантни молекули и синтез chuzheroden-Nogo протеин. Най-често рекомбинантни молекули се въвеждат в бактериални клетки чрез трансформация. Първи Bacto Ry клетки, за да се увеличи тяхната способност за абсорбиране на плазмидна ДНК се третира с калциев хлорид или бариев хлорид. След това, разтвор на клетъчна суспензия се инжектира с рекомбинантен E молекули. Някои от тези молекули да проникнат в клетките, и част от тях да се прикрепят към клетъчни мембрани започват да пролиферират и функция (фиг. 26).

Фиг. 26. типичен опит на генното инженерство (за Beckingeham-Smith, 1975)

Фиг. 27. Действие на химически синтезиран човешки соматостатиновия ген в клетки на Е.коли (не К. Itakura и др.)

Един от най-важните области за практикуване на генното инженерство - дизайн микроорганизми, които произвеждат полезни вещества. Първият в тази насока са проучвания-ЛИЗАЦИЯ К. Itakura и H. Boeyra и сътр. (1977). Те са в състояние да завърши Xia експресия на ген, кодиращ хормона соматостатин в E.coli клетки (Фиг. 27). След това в различни страни на E.coli клетки се използват за синтеза на множество протеини и човешки и животински хормони: инсулин, интерферони, формил-на растеж, урокиназа, калцитонин, албумин, тимозин, и т.н. В лаборатории A. A. Баева, Yu A. Овчиникова.. MN Kolosova, Е. D. Sverdlova и сътр. провежда генна експресия, кодират кипене-енкефалин, левкоцитен интерферон, брадикинин, сом totropin и сътр.

През последните години се отделя голямо внимание на създаването на генно модифицирани ваксини. Антигени, получени от рекомбинантни микроорганизми или клетъчни култури, в които въвежда ген Лени определени патоген. materi- получава Този метод. Ал за ваксинация срещу хепатит В, грип, малария, шап, бяс, paravirusa прасета и др. В нашата страна, направена обратната транскрипция на HCV РНК A. ДНК, кодираща вирусен протеин на хепатит В са пришити към

Вариола вируса на ДНК. В резултат на отслабена едра шарка култура свързва ви-имунитет срещу опасна болест - хепатит. Ваксината преминава производството на тест.

Щамове на бактерии, които произвеждат вещества активните-оп-организми при хора и животни могат да се използват за промишлено производство на лекарства.

В нашата страна, работи по техниките за получаване на ген-солна инженерни superproducers продукти характеристика на клетките, като например аминокиселини, витамини, ензими, и да се създаде култури активно разграждащи масло, пластичната маса разрушават нафтален определяне на азот, и т. г.